INTRODUÇÃO

O presente trabalho é a segunda etapa de um estudo cuja finalidade é verificar a viabilidade e o grau de proteção miocárdica proporcionada pela infusão intermitente anterógrada de solução cardioplégica sangüínea normotérmica. Na primeira fase, cujos resultados foram apresentados no 24° Congresso Nacional de Cirurgia Cardíaca e 1° Congresso do Mercosul de Cirurgia Cardíaca, publicado na Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular (1), mostramos que esta forma de proteção miocárdica foi eficaz em preservar a função ventricular esquerda e preservou parcialmente os níveis de glicogênio miocárdico. Os resultados desse primeiro estudo (1) foram utilizados para comparação com os obtidos nesta segunda fase do estudo, visto que a metodologia é a mesma para ambos.

Em 1980, Lazar et al. (2, 3) sugeriram a adição de glutamato à última dose de solução cardioplégica, imediatamente antes da reperfusão, visando à reversão do dano isquêmico. Posteriormente, Rosenkranz et al. (4) propuseram essa técnica tanto durante a indução, como nas doses de manutenção (5) e, posteriormente, sugeriram a associação aspartato (6). A adição deste aminoácidos tornaria o coração mais apto a suportar a isquemia e a reassumir o metabolismo aeróbio durante a reperfusão (7, 8).

O presente estudo tem por finalidade verificar se a adição de aspartato e glutamato à solução cardioplégica sangüínea normotérmica, infundida anterogradamente a cada 20 minutos, durante 60 minutos, cuja viabilidade pudemos comprovar na primeira fase do trabalho (1) acrescenta algum benefício metabólico e/ou funcional.

MATERIAL E MÉTODOS

1 Os Animais

Usaram-se coelhos da raça Nova Zelândia, machos, com peso variável de 2 kg a 3 kg. Os animais foram denominados: doadores, receptores e doadores de sangue.

Doador é o animal do qual se retirou o coração para o estudo experimental nos respectivos grupos; receptor é o coelho conectado ao aparelho utilizado para perfusão parabiótica, doador de sangue é o animal cujo sangue serviu para o preparo das solucões cardioplégicas e para transfusões no coelho receptor.

2 Anestesia

Todos os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico, na dose de 30 mg/kg de peso corpóreo, injetado por via endovenosa. Instituiu-se ventilação mecânica controlada, ciclada a pressão (respirador Takaoka, modelo 600) a 30 ciclos/min, e O2 a 100%, mediante entubação traqueal através de traqueotomia cervical.

3 Procedimento Cirúrgico

Coelho doador: para a retirada do coração, procedeu-se a esternotomia e cervicotomia medianas, ressecção do timo, dissecção da aorta e seus ramos, todos enlaçados com fios de algodão. Através de uma das artérias carótidas canulou-se a aorta ascendente com um cateter "Intracath" calibre 16 ga, por meio do qual se infundiu a solução cardioplégica, após a ligadura distal da croça. Ambas as aurículas foram abertas para evitar distensão do coração parado. Seccionando-se as veias cavas, a aorta e seus ramos, a artéria e as veias pulmonares, o coração pode ser removido.

Coelho receptor: por cervicotomia, dissecou-se uma das artérias carótidas comuns e uma das veias jugulares internas. Após a heparinização, ambos os vasos foram canulados: a artéria com "Intracath" 16 ga, introduzido até junto da aorta, e a veia com tubo de Polietileno PE 240. O cateter arterial é conectado à bomba de rolete e o venoso à linha de drenagem venosa, ambos, componentes do aparelho de reperfusão

Coelho doador de sangue: mediante laparotomia mediana, as vísceras abdominais móveis eram exteriorizadas e envolvidas com gases embebidas de solução de NaCI a 0,9%, a 37°C. A aorta infra-renal era dissecada e, após a heparinização, laqueada caudalmente e canulada cranialmente com "Intracath" 16 ga. Através dessa cânula aspirava-se, aguda e rapidamente, todo o sangue necessário para o preparo das soluções cardioplégicas. O sangue remanescente, cerca de 50 ml, era retirado para transfusão no receptor. A sangria aguda visava evitar hemodiluição e acidose por hipovolemia.

Todos os animais receberam 3 mg/kg de heparina, endovenosamente, no final do preparo cirúrgico e antes das canulações vasculares.

4 Soluções Cardioplégicas

As soluções cardioplégicas eram compostas de solução de Ringer à qual se adicionava solução de cloreto de potássio a 19,1% de forma a obter-se, após acrescentar o sangue arterial, concentração final de potássio de 30 mEq/l na 1° dose e de 18 mEq/l nas demais. Os aminoácidos foram acrescidos para uma concentração final de 13 mM de aspartato e 13 mM de glutamato de sódio (6). Cada dose tinha volume de 20 ml, sendo que 8 ml (40%) eram de sangue arterial.

5 Sistema de Reperfusão

Usou-se o sistema de reperfusão parabiótica proposto por Chen et al. (9), com algumas modificações, cujos detalhes já publicamos (1).

Durante o período de isquemia, os corações recebiam uma cânula na aorta, dois fios de marcapasso epicárdicos e um cateter, com um balão de látex em uma de suas extremidades, era introduzido, colapsado, na cavidade ventricular esquerda através da valva mitral. O anel mitral era suturado ao redor do cateter para evitar a extrusão do mesmo durante as contrações ventriculares.

A reperfusão era realizada em dois corações, simultaneamente. Cinco minutos após o reinicio espontâneo da atividade mecânica, iniciava-se a estimulação elétrica na freqüência de 180 pulsos por minutos, com amplitude de 20 mV e, só então, iniciava-se o registro das pressões intraventriculares.

Ao final do período de reperfusão, pré-estabelecido em 20 minutos, os ventrículos eram excisados ao nível do sulco atrioventricular e imersos em solução de NaCI 0,9% gelada, contida em Beckers envoltos por gelo picado e, assim, encaminhados para processamento e análise bioquímica.

6 Obtenção e Análise das Pressões Intraventriculares Esquerdas

6.1 Registro das pressões intraventriculares esquerdas

As curvas de pressão foram registradas em polígrafo "Physiograph MK-IV", de 4 canais (Narco Bio Systems Inc. Houston, Texas, USA). Os registros de ambos os corações foram tomados simultaneamente, em canais diferentes, tendo a mesma calibração elétrica e com manômetro de mercúrio, com escala de 0 mmHg a 200 mmHg (50 mmHg/cm). Utilizou-se um transdutor de pressão modelo 7179 com 8 microvolts/cm de sensibilidade (Narco Bio Systems Inc., Houston, Texas, USA ).

6.2 Cálculo manual da derivada pressão/tempo-dP/dtmax

O cálculo da dP/dt do ventrículo esquerdo foi realizado manualmente, segundo o método proposto por Aloan (10), a partir do traçado das pressões intraventriculares, 10, 15 e 20 min após o início da reperfusão, calculando-se a média das três medidas.

7 Estudo Metabólico

O estudo metabólico do miocárdio ventricular constou de:

7.1 Dosagem de glicogênio

A extração do glicogênio foi realizada pelo método proposto por Sjogreen et al. (11), a partir de 500 mg de músculo cardíaco, obtidos seccionando-se a ponta do coração. A dosagem foi realizada pelo método proposto por Hassid & Abrahan(12)

7.2 Respiração mitocondrial

Obteve-se a fração mitocondrial pela técnica de Sordahl et al. (13) e a determinação do consumo de oxigênio mitocondrial foi realizada polarograficamente, a 30°C, mediante a utilização de um oxígrafo modelo Gilson 5/6 Oxygraph (Gilson Medical Eletronics, Inc., W. Beltline Middeton, Wl, U S A ) munido de um eletrodo para oxigênio tipo Clark.

As mitocôndrias eram agitadas e colocadas na câmara de modo a obter-se 1 mg de proteína mitocondrial por ml do meio de respiração. A proteína mitocondrial foi determinada pelo método de Lowry et al. (14). O substrato oxidável utilizado foi o alfa-cetoglutarato (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA), em forma de sal potássico na concentração de 5mM. O estímulo para a captação do oxigênio (estado 3 da respiração) foi induzido pela adição de 400 nmoles de MgADP (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA).

Os parâmetros da fosforilação oxidativa foram calculados de acordo com Chance & Williams (15) e Estabrook & PuLlman (16) e foram expressos em nanoátomos de oxigênio utilizados por mg de proteína por minuto, para os estados III e IV da respiração mitocondrial.

Determinou-se a razão de controle respiratório (RCR) e consumo de oxigênio no estado III (fase ativa da fosforilação oxidativa com consumo de oxigênio e formação de ATP) e estado IV (respiração basal após todo o ADP ser fosforilado à ATP) e a razão ADP:O (dada pela quantidade de oxigênio necessário para a fosforilação total de uma quantidade conhecida de ADP.

8 Delineamento do Projeto

O estudo foi dividido em duas fases:

Fase I: Estudo metabólico após isquemia sem reperfusão.

Fase II: Estudo funcional e metabólico após reperfusão.

Fase I: Estudo metabólico após isquemia sem reperfusão.

Nesta fase foram analisados os níveis de glicogênio e a respiração mitocondrial do miocárdio de 15 corações submetidos, durante 60 minutos, à infusão intermitente de solução cardioplégica sangüínea a 37°C, com aspartato e glutamato. O tempo de infusão era de cerca de 2 minutos, com intervalo entre cada infusão de 20 minutos. Os corações foram divididos em grupos Experimental (10 corações) e Controle (5 corações). Os controles foram encaminhados para as determinações bioquímicas imediatamente após a infusão da primeira dose de cardioplegia, portanto, sem isquemia subsequente.

Fase II: Estudo metabólico e funcional após reperfusão.

Nesta fase foram estudados 17 corações. O grupo experimental (10 corações) recebeu o mesmo tratamento dos grupos da Fase I, até o final do período de 60 minutos de infusão intermitente da solução cardioplégica. Durante esse período os corações eram preparados para reperfusão. No Grupo Controle (7 corações) a reperfusão seguiu-se 5 a 7 minutos após a infusão da primeira dose de cardioplegia, tempo necessário para o preparo para a reperfusão, durante o qual os corações foram mantidos em solução de NaCI a 0,9% a 4°C.

Os resultados obtidos em ambas as fases deste estudo foram comparados com aqueles obtidos com a mesma solução cardioplégica, mas sem estes aminoácidos (1).

9 Análise Estatística

A comparação dos resultados foi realizada pelo teste T de Student, com nível de significância de 0,01. Os resultados foram expressos como média aritmética dos valores ± o erro padrão da média.

RESULTADOS

1 Glicogênio Miocárdico

Na Tabela 1 são apresentados os níveis de glicogênio miocárdico dos grupos com e sem aminoácidos, com e sem reperfusão, bem como de seus respectivos controles. Houve queda significativa do glicogênio miocárdico, em relação ao controle, de 58% e 53%, para os grupos sem e com aminoácidos, respectivamente, apenas na fase sem reperfusão. As diferenças observadas em ambos os grupos em comparação aos seus respectivos controles, após reperfusão, não foram significativas.



Quando comparamos os resultados obtidos com a cardioplegia com aminoácidos com aqueles da cardioplegia sem aminoácidos, notamos que não houve diferenças significativas, quer seja com ou sem reperfusão.

2 Respiração Mitocondrial

A Tabela 2 demonstra os resultados dos parâmetros de respiração mitocondrial (Estados III e IV, RCR e razão ADP:O) nas fases sem (Fase I) e com (Fase II) reperfusão. Notamos que não há diferenças significativas nestes parametros, quer seja de cada grupo de cardioplegia em relação ao seu respectivo controle, quer seja entre os grupos de cardioplegias com e sem aminoácidos, tanto na fase sem reperfusão como naquela com reperfusão.



3 Função Ventricular Esquerda (dP/dtmax)

Os resultados da dP/dtmax são apresentados na Tabela 3. Observou-se que os valores foram 12,87 % menores que seu controle no grupo sem aminoácido, e 20,40% menores que o seu controle no grupo com aminoácido. Entretanto, essas diferenças não foram significativas. Também não foram significativas as diferenças entre os grupos da cardioplegia sem e com aminoácidos.



COMENTÁRIOS

Durante a isquemia o coração depende da glicólise anaeróbia para produzir ATP; todavia, este processo gera apenas 2 moles de ATP para cada mol de glicose metabolizado. É, também, um processo limitado, pois o acúmulo de lactato e a mudança no potencial redox da célula, pelo acúmulo da nicotinamida-adenina-dinucleotídeo na forma reduzida (NADH), inibem o reação glicolítica(17-19). Segundo Sanborn et al (20), o glutamato, anaeróbicamente, poderia participar de uma reação de transaminação juntamente com o piruvato para formar alanina e alfa-cetoglutarato. Este último, por sua vez, entraria como substrato no ciclo de Krebs, sendo oxidado para formar succinato e GTP, produzindo, assim, 1 mol de fosfato de alta energia, independentemente de glicólise. O glutamato participaria, ainda, no metabolismo do aspartato na "Lançadeira do Malato", paralelamente ao ciclo de Krebs. Nesta via o aspartato seria transaminado em presença de alfa-cetoglutarato para formar glutamato e oxalacetato. O oxalacetato, por sua vez, seria reduzido a malato com oxidação simultânea do NADH a NAD, este, no citoplasma, permite a continuação da via glicolítica e, portanto, a produção de ATP durante a glicólise anaeróbia. Na seqüência, o malato seria reduzido a fumarato e, então, a succinato gerando mais um mol de ATP e Flavina-adenina-dinucleotídeo( FADH ). O glutamato gerado no início da "Lançadeira do Malato" pode, então, ser transaminado e formar alfa-cetoglutarato para o ciclo de Krebs. Estas reações estão esquematizadas no Gráfico 1.

GRÁFICO 1
ESQUEMA DE PARTICIPAÇÃO DO ASPARTATO E GLUTAMATO NO METABOLISMO DO MIOCÁRDIO DURANTE A ISQUEMIA. ADAPTADO DE SANBORTN ET AL. (20)



Com base no exposto, as vantagens teóricas da adição do aspartato e glutamato à solução cardioplégica seriam:

1 O glutamato, consumido durante o metabolismo anaeróbio (7 8), restabeleceria os níveis de alfa-cetoglutarato e o aspartato os níveis de oxalacetato, tornando a célula mais apta a reassumir o metabolismo aeróbio na reperfusão.

2 A geração de fosfatos de alta energia pela fosforilação ao nível do substrato (ATP e GTP), manteria a viabilidade celular durante o período de isquemia (21, 22). Segundo Pisarenko et al. (23), a queda de adenina-nucleotídeos (ATP, ADP e AMP) e glutamato mitocondriais em células miocárdicas isquêmicas, estaria relacionada à depressão do estado III da respiração mitocondrial.

3 A oxidação do FADH e NADH, sobretudo este último, na "Lançadeira do Malato", manteriam o potencial redox das células, tornando-as mais aptas a reassumir o metabolismo aeróbio na reperfusão. A redução na razão NADH/NAD preveniria ainda a inibição da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase e da alfa-cetoglutarato desidrogenase que ocorre no metabolismo anaeróbio, acelerando o metabolismo glicolítico e o ciclo de Krebs, durante a isquemia (5, 24).

4 O benefício da adição do aspartato se daria através do sinergismo de efeitos no metabolismo isquêmico dos aminoácidos, já discutido, mas, sobretudo, pela manutenção do potencial redox da célula e fornecimento de oxalacetato obtidos através da "Lançadeira de Malato" (6).

Pela analise dos resultados obtidos, fica evidente que a adição de glutamato e aspartato, ao menos nestas condições experimentais, não teve influência nos níveis de glicogênio miocárdico, visto que não houve diferença significativa, entre os grupos com e sem aminoácidos, com ou sem reperfusão. O mesmo pudemos observar em relação à respiração mitocondrial.

Com relação à recuperação funcional, ainda que tivesse observado queda da dP/dtmax de 12,87% e 20,40% para os grupos sem e com aminoácidos, respectivamente, em relação aos seus respectivos controles, estas diferenças não atingiram significância estatística. Embora a queda fosse maior no grupo com aminoácidos, ao compararmos esse resultado com o do grupo sem aminoácidos, observamos que a diferença não foi significativa.

Outros investigadores também não encontraram benefícios com a adição de aspartato e glutamato às soluções cardioplégicas ou soluções de perfusão, no que se refere a recuperação funcional após isquemia. Robertson et al. (25) não obtiveram melhores resultados com o acréscimo de glutamato à solução cardioplégica sangüínea hipotérmica, em infusão intermitente, de 4 horas de duração. Galinãnes et al. (26) trabalhando com corações preservados a 4°C, por 8 horas, concluíram que o efeito benéfico da adição de aspartato monosódico à solução cardioplégica era predominantemente devido a maior osmolaridade determinada pelo aumento da concentração do sódio. Crooke et al. (27) demonstraram, que, após 2 horas de infusão intermitente de solução cardioplégica sangüínea a 4°C, com e sem aspartato e glutamato (13 mMol/L cada), que o benefício obtido em seu protocolo se devia a infusão de uma dose da solução cardioplégica sangüínea, imediatamente antes da reperfusão, independentemente da presença destes aminoácidos ou da temperatura na qual era infundida. Jessen et al. (28), utilizando espectroscopia com ressonância nuclear magnética, em corações isolados, e perfundidos com solução contendo aspartato e glutamato, seguida de 30 minutos de isquemia, não observaram nenhuma melhora na recuperação funcional e nenhuma evidência de que tais aminoácidos tivessem participado no metabolismo no ciclo do ácido cítrico, durante a isquemia. Este achado contraria a hipótese de que estes aminoácidos favoreçam a recuperação miocárdica após isquemia, por propiciarem a síntese de intermediários do ciclo do ácido cítrico, tornando-o mais apto a reassumir o metabolismo aeróbio entre outras vantagens já citadas.

Apesar desta investigação não ter subsídios para analisarmos a participação destes aminoácidos no metabolismo do miocárdio isquêmico, há que considerar as conclusões de Jessen et al. (28), de que a ação de tais aminoácidos pode ser altamente dependente do protocolo experimental e de que os efeitos benéficos de aminoácidos exógenos poderiam ser evidenciados sob determinadas condições. É possível, portanto, que corações patológicos, com o metabolismo cronicamente alterado, como a cardiopatia isquêmica, possam se beneficiar da adição de aminoácidos à solução cardioplégica.

Concluímos que a adição de aspartato e glutamato à solução cardioplégica sangüínea normotérmica, infundida de forma intermitente a cada 20 minutos, durante 60 minutos, não se acompanhou de benefícios adicionais evidentes, com a metodologia empregada.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 Rodrigues A J, Sader A A, Vicente W V A, Bassetto S. Cardioplegia sangüínea normetérmica intermitente anterógrada: estudo experimental em coelhos. Rev Bras Cir Cardiovasc 1997; 12: 278-84.

2 Lazar H L, Buckberg G D, Manganaro A J, Becker H - Myocardial energy replenishment and reversal of ischemic damage by substrate enhancement of secundary blood cardioplegia with amino acids during reperfusion. J Thorac Cardiovasc Surg 1980; 80: 350-9.

3 Lazar H L, Buckberg G D, Manganaro A J, Becker H, Maloney J V - Reversal of ischemic damage with amino acid substrate enhancement during reperfusion. Surgery 1980; 88: 702-9.
[ Medline ]

4 Rosenkranz E R, Buckberg G D, Lacks H, Mulder D G - Warm induction of cardioplegia with glutamate-enriched blood in coronary patients with cardiogenic shock who are dependent on inotropic drugs and intra aortic balloon support. J Thorac Cardiovasc Surg 1983; 86: 507-18.

5 Rosenkranz E R, Okamoto F, Buckberg G D, Johansen J V, Robertson J M, Bugyl H - Safety of prolonged aortic clamping with blood cardioplegia. II. Glutamate enrichment in energy-depleted hearts. J Thorac Cardiovasc Surg 1984; 88: 402-10.

6 Rosenkranz E R, Okamoto F, Buckberg G D, Johansen J V, Robertson J M, Bugyi H - Safety of prolonged aortic clamping with blood cardioplegia. III. Aspartate enrichment of glutamate-blood cardioplegia in energy-depleted hearts after ischemia and reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg 1986; 91: 428-35.

7 Mudge G H, Mills R M, Taegtmeyer H, Gorlin R, Lesch M - Alterations of myocardial amino acid metabolism in chronic ischemic heart disease. J Clin Invest 1976; 58: 1185-92.

8 Wiesner R J, Deussen A, Borst M, Schrader J, Grieshaber M K - Glutamate degradation in the ischemic dog heart: contribition. to anaerobic energy production. J Mol Cell Cardiol 1989; 21: 49-59.

9 Chen C C, Morishige N, Masuda M et al. - R56865, a Na+ and Ca2+ overload inhibitor, reduces myocardial ischemia-reperfusion injury in blood-perfused rabbit hearts. J Mol Cell Cardiol 1993; 25: 1445-59.

10 Aloan L - Análise da função ventricular. In: Aloan L, ed. Hemodinâmica e angiocardiografia: obtenção de dados, interpretação e aplicações clínicas. Rio de Janeiro: Livraria Atheneu,1982. p. 123-80.

11 Sjogreen B, Nordenskjold T, Holmgren H, Mullerstromm J - Beitragzur kenntaris der leberthymithmic (glicogen, phosphos und caicium in der kaninchendeber). Arch F D Ges Physiol 1938; 240: 427.

12 Hassid W Z & Abrahan S - Chemical procedures for analysis of polysaccharides. I. Determination of glycogen and starch. In: Collowick S P & Kaplam N O, eds. Methods in enzymology. New York:, Academic Press,1957. p 34-50.

13 Sordhal L A, Johnson C, Blailok Z R, Schuwartz A - The mitochondrion. Meth Pharmacol 1971; 1: 247 - 50.

14 Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L., Randall R J - Protein measurament with the folinphenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265 - 72.

15 Chance B & Williams G R - The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv Enzimol 1956, 17: 65-134.

16 Estabrook R W & Pullman M E - Oxidations and phosphorylation. New York: Academic Press, 1967.

17 Opie L H - Cardiac metabolism - emergence, decline and resurgence. Part I. Cardiocasc Res 1992; 26: 721-33.

18 Opie L H -Myocardial ischemia-metabolic pathways and implications of increased glycolysis. Cardiovasc Drugs Ther 1990; 4: 777-90.

19 Owen P, Dennis S, Opie L H - Glucose flux rate onset of ischemic contracture in globally underperfused rat hearts. Circ Res 1990; 66: 334-54.

20 Sanborn T, Gavin W, Berkowitz S, Perille T, Lesch M - Augmented conversion of aspartate and glutamate to succinate during anoxia in rabbit heart. Am J Physiol 1979; 237: H535-41.

21 Berkowitz S, Perille T, Lesch M - Anaerobic amino acid metabolism as a potencial source in mammalian heart. Clin Res 1978; 26: 219. (Abstract).

22 Bittl J A & Shine I K - Protection of ischemic rabbit myocardium by glutamic acid. Am J Physiol 1983; 245: H406-12.

23 Pisarenko O I, Studneva I M, Solomatina E S, Kapelco V I - Adenines nucleotides, glutamate and respiratory function of heart mitochondria during acute hypoxia. Biochem Internat 1986; 13: 51-8.

24 Snaith C D, Wright G, Lofkin M - The effect of aspartate and 2-oxoglutarate upon glycolytic energy metabolites and mechanical recovery following global ischaemia in isolated rat hearts. J Cell Mol Cardiol 1992; 24: 305-15.

25 Robertson, J M, Johansen J V, Buckberg G D, Rosenkranz E R, Maloney J V - Safety of prolonged aortic clamping with blood cardioplegia I. Glutamate enrichment in normal hearts. J Thorac Cardiovasc Surg 1984; 88: 395-401.

26 Galiñanes M, Chambers D J, Hearse D J - Effect of sodium aspartate on the recovery of the rat heart from long-term hypotermic storage. J Thorac Cardiovasc Surg 1992; 103: 521-31.

27 Crooke G A, Harris L J, Grossi E A, Baumann E G, Esposito R, Spencer F C - Role of amino acids and enhancement cardioplegia in routine myocardial protection. J Thorac Cardiovasc Surg 1993; 106: 497-501.

28 Jessen M E, Kovarik T E, Jeffrey F M, Sherry A D, Storey C J - Effects of amino acids on substrate selection, anaplerosis and left ventricular function in tha ischemic reperfused rat heart. J Clin Invest 1993; 92: 831-9.